提到達芬奇，我們就會想到他著名的作品《蒙娜麗莎》。《蒙娜麗莎》帶著迷人而神秘的微笑，並且這幅畫上麵沒有簽字，沒有日期，更沒有透露畫中人的名字，這引起了人們無限遐想。很多人認為，她可能是當時意大利社會名流伊莎貝拉·德艾斯特、伊莎貝拉·古亞蘭達或塞西利婭·加萊拉妮；也有一些人認為原型是達芬奇的情婦，還有人說她是一個妓女；有人認為原型是達芬奇的母親；還有人對達芬奇的麵部線條與畫中人的麵部線條進行了對比，認為二者非常相似，於是得出結論：這是達芬奇的自畫像，他把自己畫成女人，因為他天性好玩；有人據此認為，達芬奇是同性戀。
“**者”的指控是達·芬奇一生的隱痛。1476年，他被控與17歲的男模特發生關係，在兩次聽證會後，這案子因為證據不足而不了了之。這次審判無疑給達·芬奇帶來了巨大的心靈創傷，之後的歲月裏，他竭盡所能保護自己的私生活，甚至用倒寫法隱藏真實思想。所以，一切關於他是同性戀的猜想都停留在捕風捉影的階段。
這是有據可查的直接證據，間接證據也有很多。
人們認為達·芬奇一生沒有結婚是最大的疑點，並且無任何資料顯示他熱戀過哪位女性。
1910年，身為精神病學醫生的猶太學者弗洛伊德，出版了一部題為《列奧納多·達·芬奇和他童年的一個記憶》的論文。在這篇論文
中，弗洛伊德從心理分析的角度闡釋了達·芬奇性取向的成因，做出了“達·芬奇是同性戀者”的結論。
在達·芬奇的作品中，確實有很多男女界限不分明的形象，比如在《施洗者聖約翰》這幅作品中，達·芬奇把聖約翰的臉畫得十分柔美，如果光看麵龐，人們很難斷定畫中人的性別。
長期以來，人們對此津津樂道。許多曆史學家指出達芬奇傾向於男性，他一生從未與任何女人有過親密關係，他的畫作也證明了他對男性美的迷戀。他的素描基本上隻針對男性**，對性器官的描繪尤其引人注意，而與之形成鮮明對比的是，他很少畫到女人脖子以下的部分，即便畫了，性器官也非常模糊甚至扭曲。
另外，達·芬奇筆記本裏的許多注釋暗示了他與男學生Gian Giacomo de’Caprotti的曖昧關係，據說這關係持續了20年。達·芬奇去世前不久完成的畫作《施洗聖約翰》美麗卻妖冶，畫中那男女莫辨的聖約翰原型就是Caprotti。
1910年，弗洛伊德利用達·芬奇的筆記作為原材料對其性取向進行了深入研究。他認為，達·芬奇將他的性欲表達在作品中，許多未完成的作品便是一種性挫敗的象征。
而時下風靡全球的《達芬奇密碼》裏不止一次的公然承認達芬奇是個同性戀者。500多年前，達·芬奇在他的手稿中使用了一種奇特的文字，這種文字像一種密碼，令許多人困惑。經過語言學家的努力，終於破譯了這些“密碼”。原來，達·芬奇在手稿中使用的這些文字實際是用左手寫出來的反字。
達·芬奇在去世之前，把手稿上奇怪文字的秘密告訴了他最信任的學生梅爾茨。達·芬奇此舉有著自己的打算，如果他的手稿在有生之年沒能出版，他想把多年潛心研究並精心繪製的手稿交給梅爾茨，由他幫助自己整理後出版。
梅爾茨忠厚老實，在達·芬奇晚年一直陪伴在他的左右。
有一天，達·芬奇把梅爾茨單獨叫到了一旁，悄悄地對他說：“知道嗎，要想讀懂我的手稿，你就得這樣……對著陽光，把紙翻過來看就行了。”
梅爾茨順著老師的手望去，一排排熟悉而又清楚的文字躍然紙上。他對老師的這種奇特才能讚歎不已，而達·芬奇卻示意他不要聲張，因為他隻把這個秘密告訴了梅爾茨一個人。
梅爾茨果然是個忠誠的人，在他生前，不僅完好地保存了達·芬奇的全部手稿，還嚴密地保守著如何閱讀達·芬奇手稿的秘密。然而，梅爾茨雖然忠誠，能力卻很一般，他雖然傾盡全力，但隻整理出一部未完成的《繪畫論》，這是達·芬奇留給後人的唯一著作，並且還是在梅爾茨去世後才得以出版的。．
更為不幸的是，梅爾茨的兒子奧拉奇奧對達·芬奇原始手稿的價值一無所知。他或是把手稿隨意地抽出送人，或是零散地從筆記本上撕下來賣掉，以獲取蠅頭小利。已經知道如何閱讀達·芬奇手稿的奧拉奇奧，順便將讀解這些特殊文字的秘密泄露給了別人。
現在，不少人正熱衷於研究這些“達芬奇密碼”，希望能從中找出關於達芬奇更多的秘密，其中就包括達·芬奇是不是同性戀這個問題。根據他的畫如《最後的晚餐》裏的聖約翰和《施洗者》的聖約翰，臉都畫的很柔美，要是不看他們的體態的話，是比較女性化的臉的。說明他對男女的分界線很模糊。而他究竟是不是同性戀，我們不得而知。